1. Физико-химические свойства пчелиного яда.
Пчелиный яд в том виде, в котором он выступает на жале пчелы, представляет собой прозрачную, слегка желтоватую жидкость с острым горьким вкусов и сильным ароматическим запахом. Некоторые авторы сравнивают запах пчелиного яда с запахом мёда, другие с запахом зрелых бананов. Удельный вес пчелиного яда равняется 1.1313. Яд обладает ясной кислой реакцией и вызывает покраснение синей лакмусовой бумажки. Присутствие в пчелином яде кислых веществ отчётливо доказал ещё 150 лет тому назад первый исследователь физикохимических свойств его - Феличе Фонтана (F.Fontana, 1781), профессор анатомии в Пизе. Этот исследователь убедился в кислотности яда на основании появления красной окраски при смешивании яда с соком подсолнечника или свеклы. Такую же реакцию дают, по наблюдениям Фонтана, яды шмеля и осы, в противоположность яду гадюки. При добавлении к раствору пчелиного яда соды можно заметить выделение мельчайших пузырьков газа, вероятно углекислоты (Лангер). Активная реакция яда pH=5-5.5. Несколько иные цифры получаются, если измерить концентрацию водородных ионов (pH) воды, в которой был помещён и растёрт жалящий аппарат пчелы целиком (жало+ядовитый пузырёк+ядовитые железы). Так, Вальбум (Walbum, 1915) нашёл, что pH экстракта из 120 жалящих аппаратов, сделанном в 12см3 физиологического раствора NaCl, равняется 6.89. Экрем (Ekrem, 1920) указывает, что pH 5см3 дестиллированной воды с растёртыми в ней 10 жалящими аппаратами равняется 7.65-7.7.
Пчелиный яд быстро высыхает даже при обычной комнатной температуре. При этом он может потерять до 70%своего веса и превращается в прозрачную массу упругой консистенции, несколько напоминающую подсохший гуммиарабик. Эти свойства высущенного пчелиного яда впервые описал Фонтана. "Пчелиный яд растрескивается, когда высыхает, - писал этот автор, - так же как и яд гадюки. Если взять кусочек высушенного яда между зубами и сжимать, он ведёт себя так же, как яд гадюки и все высушенные резинообразные (gummigten) вещества". Такой же "резинообразной" консистенцией обладает высушенный яд шмелей, ос и других ядовитых перепончатокрылых. Высушенный пчелиный яд легко растворяется в воде и кислотах. Он совершенно нерастворим в спирте. Водный раствор сухого яда, в отличие от нативного, уже не даёт кислой реакции.
При кипячении водного раствора пчелиного яда жидкость мутнеет вследствие образования осадка. Алкоголь с раствором пчелиного яда образует эмульсию, причём в дальнейшем выпадает осадок. Образование осадка можно получить также высаливанием раствора пчелиного яда сернокислым аммонием. Эти свойства говорят за то, что пчелиный яд представляет собой коллоидальный раствор.
При прибавлении нескольких капель азотной кислоты к нагретому до 1000С раствору пчелиного яда выпадает хлопьевидный осадок. Сулема (HgCl2) вызывает появление опалесценции, переходящей далее в образование осадка. Точно так же и азотнокислое серебро даёт помутнение раствора вследствие образования осадка. Эти реакции указывают на присутствие в пчелином яде белка. Последнее окончательно доказывается тем, что растворы яда дают цветные реакции на белки, а именно: реакцию Миллона (образование белого осадка, становящегося пурпурно-красным после нагревания, при действии раствора азотнокислых солей окиси и закиси ртути в азотной кислоте с примесью азотистой) и биуретовую реакцию (красно-фиолетовое окрашивание от медного купороса в присутствии едкой щёлочи). Наконец, пчелиный яд даёт реакции, характерные для азотистых соединений, содержащих гетероциклические группы (алкалоиды, некоторые белки).
Так, например: 1) при прибавлении к подкисленному крепкой уксусной кислотой раствору пчелиного яда несколько капель 5% железосинеродистого калия (K4Fe(CN)6) выпадает осадок; 2) осадок образуется также от нескольких капель раствора йодной ртути в йодистом калии (реактив Брюкке) или 3) от фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Пчелиный яд совсем не содержит редуцирующих углеводов (сахаров). Реакция Троммера (образование красного осадка закиси меди при прибавлении медного купороса к раствору, содержащему сахара, в присутствии едкой щелочи) и реакция Ниландера (восстановление основных солей висмута) с растворами пчелиного яда не удаются.
Ещё в 1865 г. Бер (P.Bert) сообщил о некоторых химических свойствах яда пчелы-плотницы (Xylocopa violacea), обнаруженных Клёцем (Cloez). На основании близости систематического положения пчелы-плотницы и медоносной пчелы, а также сходства в анатомическом строении их ядовитых желез можно предположить, что свойства их ядов будут также весьма близкими. Эти авторы следующим образом характеризуют физико-химические свойства яда пчелы-плотницы. Её яд, взятый на кончик языка, вызывает специфическое вкусовое ощущение, переходящее в сильное жжение. Сходное, но далеко не идентичное ощущение вызывает муравьиная кислота. Высушивание яда не уничтожает этого свойства. Яд обладает кислой реакцией и вызывает покраснение синей лакмусовой бумажки. Кислотность яда обусловливается какой-то нелетучей кислотой. Аммиак осаждает из раствора яда какое-то беловатое вещество, растворимое в кислотах. Таннин также образует белый осадок. Из кислого раствора аммиачного осадка хлористая платина осаждает желтоватое вещество. Авторы предполагают, что описанные реакции указывают на присутствие в яде какого-то органического основания, связанного с неизвестной, нелетучей кисотой.
2. Методы добывания пчелиного яда.
Остановимся вкратце на способах, посредством которых добывают пчелиный яд в количествах, необходимых для исследования.
По данным Лангера (1897), запас яда в ядовитом аппарате одной пчелы колеблется от 0,2 до 0,4мг. Вес самого жалящего аппарата (жало+железы) равняется 2мг. Если учесть, что вес одной рабочей пчелы колеблется от 60 до 180мг, то получится, что запас яда в теле одной пчелы составляет в среднем около 1/500 веса тела. Экрем (1929) определяет запас яда в теле одной пчелы со средним весом 99мг равным 0,8мг, а вес жалящего аппарата - 3мг. Эти данные как будто более близки к истине. Специальные тщательные исследования Комарова и Эрштейна (1936) показали, что от одной пчелы можно получить 0,85мг яда.
Запас яда в теле одной пчелы несомненно должен сильно вар'иировать в зависимости от времени года, возраста пчелы, её питания и расы. Однако эти вопросы, имеющие, правда, большое практическое значение при производстве препаратов пчелиного яда, выяснены ещё недостаточно. Только Ган (Hahn, 1939), ссылаясь на исследования зоолога Мюллера (E.Muller) и химика Руфа (H.Ruf), работавших по заданию химической фабрики "Мак и насл.", изготовляющей препараты пчелиного яда, приводит некоторые данные по этому вопросу. Согласно этим авторам, молодые пчёлы, только что вышедшие из ячеек, практически лишены запасов яда. Однако сейчас же начинается выработка яда ядовитой железой и к 15-му дню жизни пчела обладает максимальным запасом яда. Вслед за этим ядовитая железа начинает дегенерировать, но запас яда в ядовитом пузырьке продолжает сохраняться. Пчела, как известно, при ужалении человека или других позвоночных животных оставляет жало в коже ужаленного животного. Жалящий аппарат отрывается от брюшка, и пчела скоро погибает. Однако отрыв жала всецело определяется свойствами объекта, который жалит пчела.
При ужалении ряда беспозвоночных животных пчела может вытащить своё жало обратно, не оторвав его от брюшка. В этом случае, следовательно, пчела может жалить несколько раз в жизни. Возникает вопрос: может ли пчела восстановить запас яда в ядовитом пузырьке, если она израсходовала его в предыдущем ужалении. Ган указывает, что пчела способна восстановить израсходованный запас яда только в течение первых 15 дней её жизни, пока не началась дегенерация ядовитой железы.
Ган указывает далее, что количество яда в теле пчелы зависит также от качества пищи. Он считает, что так как пчелиный яд богат белковыми веществами, то для его обильной выработки необходимо достаточное белковое питание. При кормлении пчёл исключительно углеводной пищей количество яда значительно уменьшается. Этим он пытается объяснить колебания в количестве пчелиного яда в зависимости от времени года. Весной и летом количество яда достигает максимума. Осенью оно уменьшается, а зимой резко падает.
Количество яда в теле одной пчелы зависит также от расы пчёл. У некоторых рас оно больше, у других меньше при прочих равных условиях.
Для добывания яда из тела пчелы применяются самые разнообразные приёмы. Простейший способ заключаетсяв следующем. Пчелу схватывают пинцетом или двумя пальцами за крылья или за грудь и брюшко; при этом она выпускает своё жало, стараясь ужалить удерживающие её предметы. На жале можно заметить маленькую капельку прозрачного яда. Яд, выступающий на жале, можно собрать, отсасывая его капилярной трубочкой, или прикасаясь жалом к фильтровальной бумажке, или погружая кончик жала в воду, в которой яд хорошо растворяется. В последнем случае полученный раствор яда сразу же может быть использован для работы. Яд, собранный на фильтровальной бумажке, можно высушить и сохранять в эксикаторе в течение некоторого времени. Перед исследованием яд из бумажек должен быть экстрагирован водой или каким-либо другим растворителем. Наиболее часто яд собирается путём прикосновения жалом к стеклянной поверхности (чисто вымытые часовые, предметные или покровные стёкла). Яд быстро засыхает на стекле и хранится в сухом виде в эксикаторе. Перед употреблением яд соскабливается со стекла и растворяется в воде.
Все эти простейшие способы получения яда хороши тем, что, помимо простоты, дают возможность собрать совершенно чистый яд, не загрязнённый никакими примесями. Кроме того, пчёлы при этом не погибают и могут быть использованы вторично. Однако эти способы мало пригодны в том случае, когда надо собрать значительные количества яда, так как они очень кропотливы и трудоёмки.
Комаров и Эрштейн (1936) рекомендует собирать яд следующим образом. Пчёл схватывают одним пинцетом за грудь, а другим за брюшко. Последнее отрывают от груди, пинцетом слегка вытаскивают жало и водят им по поверхности покровного стекла до полного опорожнения ядовитого пузырька. Стёкла сушатся и хранятся в эксикаторе над хлористым кальцием. Этим способом удалось собрать значительные количества чистого яда для исследования. Этот способ, правда, не менее трудоёмок, чем предыдущие.
В тех случаях, когда надо собрать значительные количества яда, например для химического исследования или для производства лечебного препарата, обычно применяются другие способы. Многие исследователи для получения пчелиного яда выдёргивали пинцетом жала вместе с ядовитым пузырьком и ядовитыми железами. Извлечённые жалящие аппараты высушивались, затем растирались в тонкий порошок и хранились в эксикаторе. Перед употреблением порошок экстрагировался каким-либо растворителем пчелиного яда. В некоторых случаях жалящие аппараты сразу после извлечения помещались в воду с тем, чтобы яд мог продиффундировать из ядовитого пузырька и образовать водный раствор, который немедленно употреблялся для работы. Лангер извлечённые пинцетом жала, помещал в 96% алкоголь с целью коагулировать белки, затем отфильтровывал алкоголь; оставшиеся на фильтре жала высушивал при 500С и растирал в тонкий порошок. Перед употреблением он экстрагировал полученный порошок водой и подвергал дальнейшей обработке с целью очистки пчелиного яда от балластных веществ. Подобным же образом приготовляли свой препарат пчелиного яда Перрэн и Куэно (1933).
Чтобы избежать трудоёмкой процедуры извлечения жалящих аппаратов у наркотизированных пчёл, Флури предложил новый способ получения пчелиного яда. Он помещал значительное число живых пчёл в стекляную банку, закрывал её фильтровальной бумагой, которую смачивал эфиром. Пары эфира раздражали пчёл, и, перед тем как впасть в состояние лёгкого наркоза, они выпускали свой яд, который оставался на стенках банки и на телах пчёл. Когда пчёлы погружались в более глубокий наркоз, стенки сосуда и находящиеся в нём пчёлы споласкивались водой, которая растворяла пчелиный яд. Правда, раствор пчелиного яда, полученный таким образом, был сильно загрязнён мёдом и другими случайными веществами, которые могли быть на теле пчёл. Промывная жидкость, обычно мутная, жёлтого цвета, всегда обладала кислой реакцией. Сахаристые вещества, загрязняющие раствор, Флури рекомендует удалить диализом. После выпаривания воды остаток обладал всеми свойствами пчелиного яда и мог храниться в сухом состоянии в течении нескольких месяцев. Флури получал от 1000 пчёл около 50-75мг сухого остатка, представлявшего собой, по мнению Флури, пчелиный яд, загрязнённый небольшими количествами мёда. После такой операции некоторые пчёлы, обсушенные на солнце, оправлялись и улетали. Этот способ быстр и удобен, но яд, полученный таким образом, сильно загрязнён. Главный дефект такого метода заключается в том, что им никогда нельзя получить весь запас яда, имеющийся в теле пчелы. Эти недостатки заставили позднейших авторов совершенно отказаться от его употребления.
В последнее время исследователями, а также предприятиями, изготавляющими лечебные препараты пчелиного яда, употребляются способы, позволяющие получать нативный яд в совершенно чистом виде и вместе с тем гарантирующие полное извлечение запасов яда, имеющегося в теле пчелы. Таких способов два.
Согласно первому способу, впервые применённому Флури, пчёл заставляют жалить какую-либо индиферентную массу, которая легко прободалась бы жалом, но вместе с тем задерживала бы жало на своей поверхности. Для этой цели наиболее пригодны всякие волокнистые материалы. Жало пчелы, ужалившей такую волокнистую массу, остаётся в ней, вследствие того, что зазубрины колющих щетинок зацепляются за волокна массы. Пчела отрывает жалящий аппарат, и он, в силу автоматической способности к внедрению, продолжает опорожнять весь запас яда, имеющийся в ядовитом пузырьке в момент ужаления. Масса, котору жалят пчёлы, должна хорошо впитывать выделяющийся яд. После того как достаточное количество пчёл опорожнят свои жалящие аппараты в указанную массу, последняя экстрагируется какими-либо растворителями пчелиного яда, совершенно не действующими на саму массу.
Получаемый этим способом яд совершенно чист, и количество его лишь немногим меньше того запаса яда, который имелся в теле использованных пчёл. Флури впервые применил для осуществления этого способа плотную, влажную фильтровальную бумагу. Этим способом Флури мог за один день получить яд от нескольких тысяч пчёл. Флури высушивал пропитанную ядом бумагу и затем экстрагировал её по мере надобности.
Второй способ, описанный Беком (1935), особенно хорош для экспериментальных целей. Для его осуществления берут широкогорлую стеклянную банку диаметром в 2-4 дюйма и высотой в 1 дюйм; наполняют её до краёв стерильной водой и обвязывают какой-либо животной перепонкой (наиболее подходящей является высушенная мошонка барана). Пчёл, схваченных пинцетом или пальцами, заставляют жалить эту перепонку; жало пронзает её, и яд изливается непосредственно в воду, образуя раствор. Впоследствии вода может быть выпарена в вакууме, количество оставшегося сухого яда измерено и сохранено в эксикаторе до употребления.
3. Действие на пчелиный яд различных физико-химических факторов и хранение пчелиного яда.
Пока ещё в точности не установлены все составные части пчелиного яда, только фармакологический анализ позволяет установить те фракции яда, выделяемые химическим путём, в которые переходят физиологически активные части яда. Только этим методом можно разделить активные начала яда от балластных сопутствующих веществ. Точно так же и при изучении влияния на свойства пчелиного яда физико-химических факторов внешней среды, руководящим критерием, позволяющим оценить характер оказанного тем или иным агентом влияния, является определение токсичности яда, исследуемое фармакологическим путём. В связи с этим особое значение имеет вопрос о выборе фармакологического теста для исследования токсичности яда. В большинстве случаев исследователи пользовались в качестве фармакологического теста суммарным эффектом яда, выражающемся в смерти подопытных животных. Таким образом, фармакологический анализ фракций пчелиного яда сводился к определению минимальной смертельной дозы яда для какого-либо животного. Этот тест представляет ряд удобств; он прост, не требует какой-либо аппаратуры и препаровки, а главное даёт удобную количественную характеристику исследуемой фракции яда, выражающеющуюся величиной минимальной смертельной дозы. Однако он имеет и существенный недостаток, потому что выражает лишь суммарный эффект яда. Для того чтобы пояснить эту мысль, рассмотрим в качестве примера один гипотетический случай. Предположим, что активное начало яда состоит не из одного, а из трёх компонентов a, b, и c. Эти компоненты представляют собой самостоятельные химически индивидуальные вещества, причём вещество a действует на нервную систему, вещество b на кровь, а вещество c на систему кровообращения. Предположим далее, что при введении нативного яда животные погибают преимущественно от поражения нервной системы веществом a, в то время как при этой же дозе яда вещества b и c хотя и воздействуют на организм, но концентрация их недостаточна для того, чтобы убить животное. Если исследователь будет изучать влияние на пчелиный яд какого-либо агента внешней среды (например, температуры), сопровождая своё исследование определением общей токсичности яда, то он легко может впасть в ошибку. Предположим, что исследуемый агент внешней среды, воздействуя на нативный пчелиный яд, разрушил вещества b и c, не оказав никакого влияния на вещество a. В этом случае исследователь в опытах на животных сможет убедиться, что минимальная токсическая яда после воздействия на него исследуемого агента не изменилась, и он вправе будет заключить, что агент не оказывает влияния на яд. На самом деле исследуемый агент сильно изменил химический состав яда, разрушив вещества b и c, но в фармакологическом эксперименте эти изменения не нашли своего отражения, так как доминирующий эффект вещества a остался без изменения. Исследователь мог бы обнаружить изменения в действии яда только в том случае, если бы он не ограничивался определением суммарного эффекта яда, выражающегося величиной минимальной смертельной дозы, а исследовал бы у этого же животного свойства его крови и работу его органов кровообращения. Этот пример ясно показывает значение выбора фармакологического теста. Вместе с тем он доказывает необходимость более полного и подробного фармакологического анализа после того, как яд подвергался каким-либо химическим или физическим воздействиям.
К сожалению, последнее требование не всегда выполнялось, особенно старыми исследователями. Поэтому приводимые ниже данные о влиянии физико-химических факторов на активность яда требуют ряда поправок и дополнений.
Вопрос о действии различных внешних агентов на эффективность пчелиного яда имеет большое практическое значение в связи с необходимостью разработки наиболее рациональных методов хранения его. По мнению Лангера, пчелиный яд очень термостабилен. В сухом виде он выдерживает нагревание до 1000С в течение 10 дней без заметного ослабления своей токсичности. Однако это относится только лишь к некоторым компонентам яда, но не ко всему комплексу веществ, входящих в состав его. Холод, даже замораживание не уничтожают действия яда. В сухом состоянии, при тщательной защите от влажности, а также в глицериновом растворе пчелиный яд может храниться без ослабления своих токсических свойств в течение весьма долгого времени, измеряемого годами (Бек, 1935). Согласно данным Экрема (1929), хранение растворов пчелиного яда в течение 2-4 месяцев как при комнатной температуре, так и при температуре в 400С лишь в незначительной степени отражается на его токсичности. При этом в растворе яда можно заметить развитие микроорганизмов. Несколько иную картину хранения растворов пчелиного яда описывают Комаров и Эрштейн (1936). Эти авторы считают, что в водном растворе пчелиный яд медленно разрушается. По их мнению, в течение одного месяца такой раствор полностью инактивируется, при этом он желтеет, буреет, и на дне сосуда, в котором он хранится, появляется осадок, состоящий из бактерий. Точно так же, если сухой яд хратится не в эксикаторе, а во влажной атмосфере, он постепенно чернеет. Комаров и Эрштейн предприняли специальные опыты для определения условий хранения пчелиного яда. В качестве теста для определения токсичности яда они пользовались определением смертельной дозы для мышей и парамеций. Они установили, что водный раствор пчелиного яда 1:50 000 инактивируется в течении 42 дней. При бактериологическом исследовании раствор был найден стерильным. Однако если тот же раствор подвергнуть стерилизации в автоклаве в течение 1 часа при 1150С или пастеризации в течение 3 дней при 60-80градС, то он сохраняет свою активность в течение 4 1/2 месяцев.
Эти данные наводят на мысль, что в самом пчелином яде имеется фактор, приводящий к его инактивации при хранении. Высокая температура разрушает этот фактор и этим стабилизирует растворы яда.
Пчелиный яд довольно устойчив к действию кислот и щелочей. Децинормальные едкая щёлочь и серная кислота не разрушают его в течение 24-часового контакта. Лишь продолжительное нагревание раствора яда с соляной кислотой и едкой щёлочью видоизменияет его свойства. При этом пчелиный яд теряет способность вызывать местную реакцию, но сохраняет свои гемолитические свойства. Быстро инактивируют яд различные сильные окислители, например перманганат калия, персульфат калия, галоиды (хлорная и бромная вода, в меньшей степени йод), йодноватая кислота и др. Перекись водорода неспособна инактивировать яд(?).
Пчелиный яд инактивируется действием многих ферментов. По данным Лангера (1899), пепсин, панкреатин и другие протеолитические ферменты как животного, так и растительного происхождения, а также химозин и диастаза разрушительно действуют на яд. Этот факт как будто говорит за то, что по крайней мере некоторые активные начала яда связаны с белковыми его компонентами. По мнению старых авторов, пчелиный яд, подобно змеиному яду, принятый через рот, не действует. Однако Бек (1935) указывает, что наблюдались случаи отравления пчелиным ядом (головная боль, расстройства пищеварения и кровообращения) у лиц, которые, желая предотвратить ожидаемую интоксикацию, высасывали яд из ранок ужаленных пчёлами людей (как известно, подобное высасывание из ранки змеиного яда совершенно безопасно для лица со здоровой полостью рта). Таким образом, этот факт свидетельствует о некоторой эффективности пчелиного яда при приёме его через рот. Об этом же могут до известной степени говорить и данные гомеопатов, применявших Apis всегда внутрь (см.гл.I, стр.10).
Деятельность бактерий может привести к инактивации яда. Обратно - яд препятствует развитию бактерий, обладая до известной степени бактерицидными свойствами. По Лангеру, 0,1% раствор пчелиного яда задерживает рост стрептококков. Сам по себе пчелиный яд обычно совершенно свободен от бактерий, что объясняет полное отсутствие случаев первичного занесения инфекции при ужалениях пчёлами. Однако бактерицидные свойства яда недостаточны, чтобы воспрепятствовать развитию некоторых бактерий в водных растворах яда. Пивные дрожжи не влияют на яд.
По данным старых авторов пчелиный яд не диализирует через животные перепонки. Однако за последнее время получены доказательства обратного, по крайней мере в отношении некоторых компонентов яда. Активные начала яда адсорбируются животным углём.
4. Химический состав пчелиного яда и вопрос об его активных началах.
Вопрос о составных частях пчелиного яда до сего времени нельзя считать разрешённым. Повидимому, в состав яда входит большое число самых разнообразных химических соединений, среди которых имеются, с одной стороны, вещества, обладающие определёнными токсическими свойствами, а с другой - многочисленные вещества, или безразличные для живого организма, или делающиеся ядовитыми только в очень больших концентрациях.
Помимо воды, в пчелином яде содержится большое количество белковых веществ, присутствие которых доказывается самыми различными реакциями; кроме того, в состав яда входит ряд свободных кислот, которые и определяют его кислую реакцию. Среди них необходимо отметить муравьиную кислоту, которая, правда, содержится в незначительном количестве (0,001% по Лангеру и Флури), соляную кислоту и ортофосфорную кислоту.
Липоидная фракция пчелиного яда также содержит целый ряд компонентов. Теч и Вольф (Tetsch, C. и Wolff, K.,1936), фракционировавшие химически пчелиный яд, указывают, что, экстрагируя водный раствор нативного пчелиного яда эфиром, можно изолировать какое-то вещество, обладающее интенсивным медовым запахом. Указанные авторы находили это вещество только в яде, полученном от летних пчёл. Это вещество, вероятно, обусловливает тот характерный запах, который ощущается даже на открытом воздухе в момент ужаления пчелой. Следует отметить любопытное наблюдение Форстера (1937), который описал различные аллергические реакции у работниц, занятых приготовлением пчелиного яда, причём вызывающим эти реакции фактором Форстер считает именно данное пахучее вещество яда.
Далее, Теч и Вольф получили посредством экстракции хлороформом вторую фракцию яда, которая давала реакции, характерные для стеринов (реакции Сальковского и Либерманна). Вещества этой фракции после удаления хлороформа образовывали кристаллы в виде длинных тонких игл, которые плавились при 120градС. Как эфирная, так и хлороформенная фракции пчелиного яда не ядовиты и не оказывали никакого действия на изолированную кишку морской свинки. Бек (1935) указывает, что в пчелином яде, содержатся какие-то очень летучие масла, которые испаряются, когда яд высыхает. Он склонен приписать этим летучим маслам ведущую роль в возниконовении жжения и боли при ужалении пчелой. Это мнение он подкрепляет ссылкой на безболезненность введения высушенного и вновь растворённого яда, в котором эти летучие масла должны отсутствовать.
Углеводы, по видимому, совершенно отсутствуют в пчелином яде. Во всяком случае, как мы указывали выше, реакции Ниландера и Трюммера, характерные для сахаров, с пчелиным ядом не удаются.
Большой интерес представляют минеральные составные части пчелиного яда. Этот вопрос был тщательно изучен Ганом и Ледичке (Leditschke, 1936). Прибавление аммиака к пчелиному яду вызывает образование красивых кристаллов, которые представляют собой MgNH4PO4. Это указывает на присутствие в яде фосфорнокислого магния Mg3(PO4)2, который, как известно, образует с аммиаком труднорастворимое в аммиаке соединение. Летом 1000 пчёл доставляют 465мг "сырого" яда; из этого количества можно получить 10мг MgNH4PO4. Зимой от 1000 пчёл получают 250мг яда, которые дают 5мг MgNH4PO4.
Следовательно, фосфорнокислый магний является одной из главнейших минеральных составных частей яда и находится в нём в значительных количествах. Для того чтобы определить другие составные части золы пчелиного яда, Ган и Ледичке исследовали яд спектрографически. Они нашли, что магний - практически единственный металл в пчелином яде. Кроме магния, они обнаружили в золе яда только лишь следы меди и кальция. При этом они полагают, что присутствие последнего металла - лишь результат загрязнения яда. Количество магния составляет 0,4% от веса высушенного яда. Исключительный интерес представляет факт отсутствия таких биологически важных и широкораспространённых элементов, как натрий, калий и железо. Ган и Ледичке своей тщательной работой опровергли укоренившееся в литературе мнение о присутствии в пчелином яде солей натрия и кальция (Бек, 1935).
Мы перечислили входящие в состав пчелиного яда вещества, которые не обладают токсическим действием, т.е. являются или балластными, или веществами, токсический эффект которых выражен слабо (кислоты, эфирная и хлороформенная фракции яда). В отношении токсического значения белковой фракции яда в настоящее время среди исследователей нет единодушного мнения. Некоторые авторы считают, что вся белковая фракция представляет собой лишь лишённые ядовитости балластные вещества (Лангер), другие, наоборот, полагают, что активное начало яда представляет собой белковое тело - токсический протеин. Ниже мы более подробно разберём этот вопрос. Пока отметим только, что токсическое значение белков пчелиного яда ещё недостаточно выяснено. Возможно, что среди веществ, входящих в состав пчелиного яда, имеются как балластные, так и токсические протеины. Что же касается минеральной фракции яда, то токсическое значение её, особенно по отношению к беспозвоночным, вряд ли может быть подвергнуто сомнению. Как известно, магний обладает ярко выраженными наркотическими свойствами. Животное, получившее токсическую дозу магния, полностью теряет способность двигаться вследствие паралича центральной и периферической нервной системы. Антагонистом магния является кальций, который уничтожает состояние "магнезиального наркоза". Большая концентрация в пчелином яде магния, а также отсутствие кальция, который мог бы уравновесить токсический эффект магния, заставляют при анализе токсического эффекта яда учитывать возможное токсическое действие его минеральной фракции, особенно на беспозвоночных животных.
Недавно в пчелином яде было обнаружено ещё одно вещество, обладающее ярко выраженным токсическим действием, а именно гистами. Впервые Нагамиту (G.Nagamitu, 1935), предприняв электродиализ растворов пчелиного яда, показал, что на отрицательном полюсе собирается вещество, обладающее местным действием на кожу (краснота, образование волдыря), а на положительном - вещество, вызывающее гемолиз. Вещество, собирающееся на отрицательном полюсе, оказалось гистамином и инактивировалось гистаминазой. Несколько позднее Райнерт (M.Reinert, 1936, 1937) окончательно доказал присутствие в пчелином яде гистамина в значительных количествах, достигающих 1% по отношению к сухому веществу. Этот факт подтвердили Теч и Вольф (1936), которые указывают, что гистамин можно обнаружить посредством реакции Паули и фармакологического исследования как в нативном, так и в обезбелоченном кипячением пчелином яде. Они выделили гистамин в форме трудно растворимого пикрата гистамина путём выпаривания фильтрата после осаждения раствора пчелиного яда насыщенным раствором пикриновой кислоты. Фельдберг и Келлеуей (Feldberg и Kellaway, 1937) произвели количественное определение гистамина в различных препаратах пчелиного яда, пользуясь фармакологическими методами. Они нашли, что концентрация гистамина в грубо очищенном препарате пчелиного яда ("Hermette" Bull), содержащем яд от 50 пчёл, в 1см3 равняется приблизительно 1:17 000. Более очищенные препараты содержали значительно меньше гистамина. Марку и Деревичи (Marcou et Derevici, 1937) изучили содержание гистамина в пчелином яде по сравнению с содержанием его в органах пчелы, пользуясь для этой цели фармакологическими методами. Результаты их работы приведены в таб.1.
Из этой таблицы видно, что гистамин находится во всех органах пчелы. Однако наибольшее его количество сконцентрировано в ядовитом аппарате и в яде пчелы. Авторы полагают, что кислая ядовитая железа пчелы обладает способностью концентрировать и выделять гистамин, циркулирующий в гемолимфе. Щелочная железа, по мнению авторов, должна быть лишена этой способности, так как гистамин разрушается в щелочной среде.
Обнаружение в пчелином яде магния и гистамина, веществ, несомненно обладающих физиологической активностью, ещё не решает вопроса об активных началах пчелиного яда. Симптомы отравления и фармакологические свойства яда, которые подробно будут описаны в следующей главе, не могут быть объяснены присутствием в яде только этих ядовитых веществ. Наоборот, вероятнее всего, что важнейшие токсические активные начала яда в настоящее время нам ещё неизвестны. Хотя вопрос об активных началах яда обсуждался в научной литературе в течение полутора столетий, однако до сего времени мы имеем весьма небольшое количество твёрдо установленных фактов, на основании которых мы смогли бы судить о химии активных начал яда.
Первые исследователи пчелиного яда считали основным действующим началом его муравьиную кислоту. Это заключение делалось на основании кислой реакции и жгучего вкуса пчелиного яда, а также по аналогии с ядом близких родственников пчёл - муравьёв, у которых муравьиная кислота представляет важнейшую составную часть яда. Однако уже некоторые современники авторов этой теории подвергали её резкой критике. Так, например Феличе Фонтана (1781) весьма убедительно и остроумно доказывал, что присутствием муравьиной кислоты нельзя объяснить боль, воспаление и опухоль, вызываемые пчелиным ужалением. Позднее Бер (1865) также пришёл к заключению, что муравьиная кислота не является активным началом яда пчелы-плотницы. Как мы уже указывали выше, этот автор предполагал, что активным началом яда является органическое основание, связанное с какой-то нелетучей кислотой. Лангер, Флури и некоторые другие авторы окончательно доказали, что муравьиная кислота не играет ни какой роли в процессе отравления пчелиным ядом. Их доказательства могут быть сведены к следующему: 1)высушенный яд, реагирующий щелочно, вызывает типичную местную реакцию, как и нативный яд; 2) яд, нейтрализованный содой, также даёт типичную реакцию, в частности характерное воспаление конъюктивы глаз кролика (Лангер); 3) 1% раствор муравьиной кислоты не вызывает типичного конъюктивита и даёт лишь незначительную гиперемию конъюктивы; 4) укол кожи высушенным жалом даёт эффект, вполне сходный с эффектом ужаления пчелой; 5) при уколе кожи иглой и введении 1% раствора муравьиной кислоты отмечается только боль и лёгкое воспаление.
Лангер (1897), представивший перечисленные выше доказательства против отожествления активного начала пчелиного яда с муравьиной кислотой, был сторонником точки зрения Бера. Он предполагал, что активное начало яда представляет собой термостабильное органическое соединение, осаждаемое аммиаком и дающее реакции, свойственные алкалоидам. Он пытался выделить химическим путём это активное начало яда и, по его мнению, достиг цели. Он поступал следующим образом. У пчёл, убитых хлороформом, пинцетом извлекались жалящие аппараты, которые фиксировались в 96% алкоголе, сушились при 500С и растирались в порошок. Этот порошок являлся исходным материалом для получения активного начала яда. Далее порошок экстрагировался водой в течение 24 часов. Водный экстракт фильтровался и сливался в 96% алкоголь, где выпадал осадок, состоящий из белковых веществ и активного начала яда. Осадок, несколько раз промытый спиртом и в заключение эфиром, высушивался и в таком виде мог сохраняться. Для отделения предполагаемого активного начала яда от сопутствующих балластных веществ (главным образом белков) Лангер приготовлял снова водный раствор осадка, содержащего яд, и приливал к нему по каплям концентрированный аммиак; выпадающий творожистый осадок отфильтровывался. Фильтрат, слегка желтоватый, даёт биуретовую реакцию. Осадок даёт ярко выраженную реакцию на конъюктиве кролика; он постепенно краснеет на воздухе. Для дальнейшей очистки осадок растворяют в уксусной кислоте и снова осаждают аммиаком. Эту операцию повторяют до тех пор, пока осадок не перестаёт давать биуретовую реакцию. Свободный от белков продукт, получивший название лангеровского основания, раньше принимали за активное начало яда. Лангеровское основание обладает весьма большой токсичностью и по своим химическим свойствам напоминает алкалоиды.
Представление об активном начале яда как об алкалоиде продержалось в науке недолго. Против этого говорят некоторые химические свойства лангеровского основания, например растворимость, неспособность образовывать определённые соли и т.д. Флури (1920) окончательно доказал, что основание Лангера не является химически индивидуальным телом, а представляет собой смесь ряда весьма разнообразных веществ. Посредством гидролиза лангеровского основания разбавленной соляной кислотой Флури смог доказать наличие в гидролизате лецитина (в хлороформенном экстракте гидролизата), триптофана, холина и какого-то некристаллического вещества, плавящегося при 630С и устойчивого к окислению, вероятно пальмитиновой кислоты. Далее, на основании акролеинового запаха, получающегося при нагревании гидролизата с бисульфитом калия Флури заключил о присутствии в нём глицерина, а на основании реакции с молибденовой кислотой - о присутствии MgNH4PO4. Кроме того, он обнаружил в гидролизате жирные кислоты и, наконец, выделил какое-то безазотистое, сильно ядовитое вещество, которое он считал активным началом яда. В зависимости от способа добывания, это активное начало получалось в двух формах: в виде нейтрального соединения, труднорастворимого в воде (циклический ангидрид кислоты), и в виде кислого, легко растворимого соединения. Нейтральное соединение растворялось в ацетоне и хлороформе. По своим свойствам оно напоминало кантаридин шпанских мушек; растворённое в льняном масле, оно вызывало образование волдырей на коже. Кислое вещество обладало сильным гемолитическим действием и напоминало по своим свойствам сапониноподобное вещество. Из нейтрального вещества легко получить кислое, растворимое в воде соединение посредством кипячения с кислотой. Так, например, если нейтрально соединение прокипятить с 15% H2SO4, нейтрализовать содой и осадить сернокислым аммонием или хлористым натрием, то получается легко растворимое в воде аморфное вещество, обладающее сапонинными свойствами: оно сильно пенится, вызывает конъюктивит на глазе кролика и обладает гемолитическими свойствами. Добавление лецитина, растворённого в метиловом спирте, усиливает, а холестерина - тормозит его гемолитическое действие.
На основании этих данных Флури характеризует активное начало пчелиного яда, как вещество промежуточное, между небелковыми сапотоксинами животного происхождения, напоминающее сапотоксины змеиного яда, и веществами группы кантаридина. Во всяком случае Флури представлял себе активное начало пчелиного яда веществом сравнительно простого строения, не связанного с белками и находящимися в соединении с лецитином.
Помимо этого, Флури показал, что активное начало яда может быть получено и другими путями, например, осаждением сернокислым аммонием, хлористым натрием и метафосфорной кислотой, но тогда оно получалось связанным с белками; приготовленные таким способом весьма активные осадки давали биуретовую и Миллонову реакции. Интересные работы по изучению активного начала пчелиного яда были проделаны Моргенротом и Карпи (Morgenroth и Carpi, 1906) и Карпи (1909).
Эти авторы пытались установить аналогию между активным началом пчелиного яда и животными токсинами, характерными для яда змей, скорпионов и других животных. Все эти токсины обладают мощным гемолитическим действием и, по мнению авторов, представляют вещества липоидного характера, действие которых усиливается от присоединения лецитина. Активное начало яда поэтому они называют пролецитидом, а соединение пролецитида с лецитином - токсолецитидом.
Как пролецитиды, так и токсолецитиды животных ядов являются антигенами. Токсолецитиды растворяются в воде и дают биуретовую реакцию. Однако по своей растворимости, термостабильности и некоторым другим свойствам токсолецитиды отличаются от пролецитидов. Моргенрот и Карпи (1906) показали сходство пчелиного яда со змениным, доказав присутствие в первом пролецитида, имеющего характер амбоцептора и образующего с лецитином гемолитический токсолецитид.
Впоследствии Карпи (1909) дополнил и расширил эти данные. Он подтвердил данные предыдущих исследователей о сильном гемолитическом действии пчелиного яда и доказал усиление этого действия под влиянием лецитина. Яд он получал экстракцией глицерином высушенных и растёртых в порошок жалящих аппаратов пчёл; лецитин он прибавлял растворённым в метиловом спирте (5%) в разведении 1:100. Оказалось, что после прибавления лецитина гемолитическая сила яда возрастала для эритроцитов кролика в 50-100 раз, для морской свинки в 250, для козы в 200-500 и для человека в 1000 раз. Эритроциты быка не гемолизируются пчелиным ядом без лецитина; кровь голубя даже после прибавления лецитина мало чувствительна.
Пролецитиды пчелиного яда нельзя назвать термостабильными, активности их ослабляется кипячением. Карпи отмечает также, что инкубация яда при температуре 37-400С ведёт к ослаблению его гемолитической активности, что объясняется, по мнению автора, присутствием определённых ферментов в самом яде. Токсолецитид в противоположность пролецитиду является термостабильным.
Для выделения и очистки токсолецитида (лецитидов) пчелиного яда Карпи поступал следующим образом: 1) к 10см3 основного раствора пчелиного яда приливается 15см3 5% раствора лецитина в метиловом спирте; 2) после 24 часов хранения этой смеси при 370С она осаждается 150см3 этилового спирта; осадок отфильтровывается; 3) фильтрат упаривается на водяной бане приблизительно до объёма в 40см3 и осаждается 150см3 эфира; 4) беловатый хлопьевидный осадок оставляется н 24 часа, декантируется ( сливание жидкости с отстоявшегося осадка) и высушивается. Перед употреблением осадок может быть растворён в физиологическом растворе хлористого натрия.
Холестерин и нормальная лошадиная сыворотка ослабляют гемолитическую активность пчелиного яда. Пищеварительные ферменты (пепсин, панкреатин) инактивируют пролецитид яда и по отношению к нему возможна иммунизация животных (морская свинка).
На основании этих данных Карпи причисляет активные начала пчелиного яда к истинным токсинам.
Изложенные исследования Лангера, Флури и Моргенрота и Карпи положили начало изучению химии пчелиного яда. Однако все эти авторы делали ошибку, пытаясь найти и охарактеризовать какое-то одно химическое соединение в качестве активного начала пчелиного яда. В настоящее время для нас совершенно несомненно, что токсическое действие яда обусловливается не одним, а многими ядовитыми веществами. Впервые эту точку зрения пытался обосновать Цезарь Физалис (1904). Этот автор изучил действие пчелиного яда на воробьях. Он наблюдал, что птица, ужаленная пчёлами, реагирует местной реакцией, выражающейся в поражении тех тканей, по соседству с которыми нанесено ужаление, судорогами и общим параличом, приводящим к смерти животного от остановки дыхания. Соответственно этому Физалис различает в пчелином яде три токсикологически активных компонента: во-первых, вещество, обусловливающее местное, воспалительное и некротизирующее действие; во-вторых, вещество, вызывающее судороги, и, в-третьих, вещество, обладающее паралитическим действием. Существование этих трёх компонентов доказывается, по Физалис, их неодинаковым отношением к агентам внешней среды. Так, например, при нагревании раствора пчелиного яда до 1000С уже через 15 минут разрушается вещество, обусловливающее местное действие, яд продолжает вызывать судороги и паралич, но лишается способности обусловить местную реакцию. При нагревании яда до 1000С в течении 30 минут разрушается вещество, вызывающее судороги, и животные погибают при явлениях полного паралича, без конвульсий. Яд инактивируется совершенно только при нагревании до 1500С в течении 15 минут. Отсюда следует, что наиболее термостабильным является компонент, действующий на животных парализующим образом.
При продолжительном стоянии раствора пчелиного яда на воздухе в первую очередь теряется его свойство вызывать судороги. Местная реакция и парализующее действие ещё долгое время сохраняются. Этот факт говорит также о различной химической природе указанных выше трёх токсических компонентов пчелиного яда. Наконец, по данным Физалис, фильтрование раствора пчелиного яда через фильтр Беркфельда задерживает компоненты, обусловливающие местное и судорожное действие, пропуская только вещество, вызывающее паралич.
Физалис предполагал, что вещества, обусловливающие местное и парализующее действие, вырабатываются в кислой железе, а вещество, вызывающее судороги, в щелочной железе. Он отпрепаровывал ядовитые пузырьки вместе с кислой железой и помещал их в сосуд с водой, где осторожно разрывал ядовитый пузырёк. Полученный таким образом ядовитый секрет исключительно кислой железы вызывал на воробьях только местное и парализующее действие. Отсюда Физалис заключил, что вещество, обладающее свойством вызывать судороги, вырабатывается в щелочной железе.
Эти старые данные Физалис были недавно подтверждены в целой серии работ Г.Гана и его сотрудников (1936-1939). Работы этих исследователей, представляющие исключительный интерес с точки зрения изучения химии пчелиного яда, окончательно доказали наличие в яде, помимо магния и гистамина, ещё по крайней мере двух токсических веществ, из которых одно вызывает у животных судороги, а другое параличи. Остановимся на работах этих авторов более подробно.
В своих работах Ган и его сотрудники [Остермайер (Ostermayer), Ледичке (Leditschke), Фернхольц (Fernholz)] в качестве фармакологического контрольного теста пользовались определением смертельной дозы яда для белых мышей. Они установили, что 0,05г нативного яда, введённого под кожу мышке, вызывает сначала апатию, затем судороги и, наконец, смерть от остановки дыхания. Яд они собирали, заставляя пчёл жалить какую-либо подходящую массу, из которой в дальнейшем экстрагировали соответствующим растворителем пчелиный яд.
Первый вопрос, который они исследовали, это вопрос о наилучшем растворителе для пчелиного яда. Они испробовали для этой цели дестиллированную воду, слабый раствор щёлочи (аммиака) и слабый раствор кислоты (муравьиной). Оказалось, что последний растворитель давал наилучшие результаты, так как экстрагировал материал наиболее полно (таб.2).
Кроме того, преимущество экстракции муравьиной кислотой (pH=4) заключалось в том, что она консервировала растворы яда. Водные растворы яда, напротив, сохранялись плохо. Далее, авторы отмечают, что температура в 1000С видоизменяет яд; поэтому все экстракты выпаривались под сильным вакуумом при 20-300С и сушились до постоянного веса над пятиокисью фосфора (P2O5). Анализ одного препарата, полученного описанным выше способом, дал следующие количества: N - 11,42%; S - 1,10%; P - 1,09%.
Для очистки и концентрирования яда Ган предложил новый весьма интересный способ последовательного экстрагирования абсолютно сухого яда спиртом, содержащим разные количества воды. Абсолютный спирт (100%) извлекает из яда значительные количества балластных веществ, совершенно лишённых токсичности. Остаток яда, далее, экстрагируется последовательно 90, 80 и 70% спиртом; эти спирты извлекают из остатка яда лишь незначительные количества неактивных веществ. Далее экстракция проводится проводится 60% спиртом, при этом алкоголь извлекает почти половину всего количества сухого вещества яда. Вещество это уже содержит активные начала яда и обладает высокой токсичностью. Остаток яда, напротив, обладает лишь слабым токсическим действием и, по видимому, в главной своей части состоит из балластных веществ. Количества сухого вещества яда, переходящие в различные фракции, представленыв таб.3.
Если слабо токсичный остаток яда подвергнуть снова описанной последовательной экстракции алкоголем в постепенно убывающей концентрации, то можно выделить ещё 0,164г сильно токсичного 60% экстракта. Если повторить эту операцию с высокоактивной фракцией, извлечённой 60% алкоголем, то из неё можно выделить в свою очередь 0,110г неактивных балластных веществ. Таким образом, общий итог получается следующий: из 3,2472г необработанного сухого яда выделяется 1,234 высокоактивного яда и 1,9332 неактивных, балластных веществ.
Очищенный высокоактивный препарат яда представляет собой белый негигроскопичный порошок. В воде он легко растворяется, образуя прозрачный неокрашенный раствор, который даже при кипячении не образует мути. Концентрированный аммиак, а ещё лучше пропускание газообразного NH3 вызывают выпадение хлопьевидного осадка, плохо растворимого в воде, но хорошо растворяющегося в разведённых кислотах.
Анализ полученного высокоактивного препарата даёт следующие данные:
-необработанный сухой яд: N - 11,42%, S - 1,10, P - 1,09;
-экстракт абсол. алкоголем: N - 10,35%, S - 0,53, P - 0,56;
-экстракт 60% алкоголем: N - 13,78%, S - 1,67, P - 1,17.
Препарат даёт положительные реакции на белки (биуретовую, ксантопротеиновую, осаждение сульфатом аммония и 95% алкоголем). Однако проба на кипячение, наслаивание раствора яда с азотной кислотой и кипячение с Na2SO4 и уксусной кислотой дают отрицательные результаты. На основании этих данных можно предположить, что активные начала яда связаны с белками или представляют собой соединения, близкие к белковым телам. В этом препарате можно также доказать присутствие фосфата магния.
Гану и Ледичке (1937) удалось доказать, что высокоактивная фракция яда состоит из двух компонентов, по разному относящихся к воздействию агентов внешней среды. Они заметили, что после воздействия на яд высокой температуры мыши погибают от него без судорог при явлениях паралича. Это наблюдение послужило авторам отправным пунктом для исследования, причём они предположили, что активные начала яда состоят, во-первых, из термолабильного компонента, вызывающего судороги и во-вторых, термостабильного компонента, вызывающего параличи. Это предположение вполне гармонирует с данными Цезаря Физалис, на которых мы останавливались выше.
Впервые Гану и Ледичке удалось разделить эти два компонента яда посредством диализа. Вопреки мнению Лангера и Флури, эти авторы доказали, что некоторые физиологически-активные составные части яда способны легко диализировать. Диализ проводился авторами следующим образом: определённые количества пчелиного яда при pH=4 (муравьиная кислота) диализировались через мембрану Шлейхера и Шуля в течение многих дней против дестиллированной воды (рис.18) или против слабого раствора муравьиной кислоты, pH которого также равнялся 4 (рис.19).
Диализат, собранный за 24 часа удалялся и вместо него добавлялись свежий раствор кислоты или вода; таким образом, получались суточные фракции диализата. Результаты диализа представлены на рис.18 и 19 и в таб.4, рассматривая которые можно убедиться, что в пчелином яде есть вещества, которые легко диализируют. Суточные фракции яда вплоть до фракции 11-го дня вызывают смерть животного при явлениях сильных судорог. Все дальнейшие суточные фракции диализата, начиная с фракции 12-го дня, так же как и остаток после диализа, вызывают смерть животного без судорог при явлениях паралича. Фракция диализата 4-го дня интересна тем, что в ней диализат вызывает смерть животных при явлениях сильных судорог, остаток также приводит к смерти животного, но уже без судорог, при явлениях паралича. В этот момент диализа, следовательно, происходит разделение активных начал яда на два компонента. Правда, как показывает дальнейший ход диализа, в остатке 4-го дня ещё сохраняется компонент, вызывающий судороги, но действие его не успевает проявляться, вследствие наступления смерти животного под влиянием компонента, вызывающего паралич. Вначале авторы предполагали, что компонент, вызывающий паралич, совсем не диализирует, но впоследствии убедились, что и это вещество отчасти может проходить через мембрану. Его можно обнаружить в диализате после 12-го дня диализа, когда первый компонент уже полностью продиализировал. Таким образом, оба компонента способны к диализу, но молекулы компонента, вызывающего судороги, во много раз меньше молекул второго компонента, что обусловливает значительную разницу в скорости диализа. Последнее обстоятельство позволяет не только разделение, но и получение обоих компонентов в относительно чистом виде.
Данные анализа дневных фракций диализата даны в таб.4. Надо отметить, что во фракции диализата 1-го и 2-го дня содержатся балластные, гигроскопические вещества, обусловливающие на воздухе сиропообразное расплывание полученного твёрдого остатка диализата. Начиная с 3-й фракции получается негигроскопический порошок. Характерным является параллелизм между содержанием фосфора и судорожным действием диализатов. По ходу диализа содержание фосфора сначала возрастает, потом постепенно снижается параллельно уменьшению количества компонента, вызывающего судороги. Максимума фосфор достигает во фракции 3-го дня, когда гигроскопические закрязнения и неорганический фосфор Mg3(PO4)2 уже успевают полностью продиализировать; отсюда авторы делают вывод, что судорожный компонент яда представляет собой быстро диализирующее органическое соединение фосфора. Содержание серы кажется одинаковым для обоих компонентов. Как было сказано выше, компонент, вызывающией судороги, не является термостабильным и разрушается как в кислой и нейтральной, так и в щелочной среде при двухчасовом нагревании на водяной бане; компонент, вызывающий паралич, совершенно не меняется в этих условиях.
Сотруднице Гана, Фернхольц, удалось разделить оба компонента пчелиного яда химическим путём. Для этого она насыщала очищенный раствор яда аммиачным газом пр 0градС. Компонент, вызывающий судороги, остаётся в растворе, возможно, в виде аммиачной соли, а компонент, вызывающий паралич, выпадает густыми бесцветными хлопьями. Первый компонент выделяется выпариванием аммиачного раствора в сильном вакууме и представляет собой кислореагирующее смолообразное вещество, легко растворяющееся в воде. Реакции на белки с ним не удаются. Действие его на животных сводится к сильнейшим судорогам. Компонент, вызывающий паралич, получаемый в виде хлопьевидного осадка, трудно растворяется в воде, но легко в разведённых кислотах. Реакции на белки (биуретовая, осаждение пикриновой и азотной кислотой, а также алкоголем) получаются положительными. Он обладает гемолитическим и нейротоксическим действием, а также действием, повреждающим ткани.
Пикриновая кислота не даёт осадка с компонентом, вызывающим судороги. Но если осадить пикриновой кислотой нативный яд, то в осадке окажется оба компонента яда. Из этого факта авторы заключают, что оба компонента в нативном яде образуют солеобразное соединение, которое не разлагается водными растворами пикриновой кислоты, но как таковое образует пикрат.
Таким образом, Ган и его сотрудники представляют себе активное начало яда солеобразным соединением, состоящим из двух компонентов. Первый компонент, вызывающий у животных судороги, представляет собой слабую кислоту, неустойчивую в свободном состоянии и характеризующуюся высоким содержанием фосфора. Второй компонент, вызывающий у животных параличи, представляет собой высокомолекулярное слабое основание, дающее реакции на белки и труднорастворимое в воде. Солеобразное соединение обоих компонентов значительно повышает устойчивость первого компонента. В воде это солеобразное соединение подвергается гидролизу:
Кислая среда препятствует гидролизу яда. Напротив, гидролиз тем интенсивнее, чем щелочнее среда. Это явствует из опытов с диализом. На рис.18 представлен опыт, где яд, растворённый в муравьиной кислоте (pH=4), диализировал в дестиллированную воду. Следовательно, его pH по мере продолжения диализа должен был всё время сдвигаться ближе к нейтральной точке. Первый компонент в этом случае полностью продиализировал уже на 8-й день. На рис.19 представлен сход диализа яда, pH которого всё время равнялся 4, так как диализ проводился не против воды, а против раствора муравьиной кислоты при pH=4. Здесь для полного удаления первого компонента понадобилось 35 дней. Щелочь, в частности аммиак, разлагает солеобразное соединение. В воде это соединение растворимо лишь отчасти, вследствие гидролиза. Поэтому в качестве растворителя необходимо пользоваться слабым раствором кислоты.
Наличие в нативном пчелином яде небольших количеств муравьиной кислоты, помимо консервирующего, имеет ещё значение растворителя солеобразного соединения. Исключительный интерес, особенно с точки зрения эволюционной теории, имеет тот факт, что действие 2-го компонента, обусловливающего параличи, во многих деталях сходно с действием змеиного яда, в частности яда гадюки Bothrops alternata.
Большое значение имеет также отмеченный Ганом и его сотрудниками факт, что активное начало яда представляет собой тело, близкое к белкам. Старые авторы, в том числе Лангер и Флури, считали, что активные начала яда представляют собой вещества небелковой природы и простого строения. Однако все новейшие исследователи химии пчелиного яда склонны считать его активные начала веществами, близкими к белкам.
В 1936г. Рейнерт опубликовал упоминавшуюся уже выше работу, в которой он пытается доказать, что пчелиный яд состоит из ряда различных биологических активных веществ. Среди этих веществ Рейнерт особо отмечает наличие гистамина. Однако он считает, что количества гистамина, выделяющиеся при ужалении пчелой, настолько малы (1?), что ими нельзя объяснить токсичности пчелиного ужаления. Основным токсикологически активным веществом яда Рейнерт считает белковое тело (протеозу).
К аналогичным выводам пришли также Теч и Вольф (1936). Эти авторы получали пчелиный яд по методу Бека, удаляли затем липоидную фракцию яда последовательной экстракцией эфиром и хлороформом и осаждали яд насыщенным водным раствором пикриновой кислоты. На основании изложенных выше данных Гана, мы можем предполагать, что при этом Теч и Вольф получали в осадке пикрат солеобразного соединения обоих компонентов пчелиного яда. Осадок они центрифугировали, растворяли в разведённом спирте и вновь осаждали слабо подкисленным ацетоном. Полученный осадок, повторно промытый ацетоном, они высушивали в вакуумэксикаторе. Фракционировать его дальше им не удалось. Этот осадок представляет собой белоснежную массу, которая легко растворяется в воде, а также в метиловом спирте и феноле. Он даёт реакции, характерные для белков. Элементарный анализ его даёт следующие данные (в процентах): C - 43,6; H - 7,1; N - 13,6; S - 2,6.
Это вещество обладает громадной токсичностью, 6-10? этого вещества под кожу на 1г веса тела представляет собой смертельную дозу для белых мышей. Теч и Вольф считают это вещество активным началом яда и назвали его апитоксином (Apitoxin).
Интересно отметить, что из яда гремучей змеи и скорпиона Теч и Вольф смогли выделить посредством аналогичного метода вещества со сходными химическими свойствами, обладающие громадной токсичностью. То же можно сказать и о яде кобры (по исследованиям других авторов). В таб.5 представлены соответствующие сравнительные данные.
Сопоставляя эти данные, Теч и Вольф заключают, что между активными началами ядов, полученными от животных, стоящих друг от друга в таксономическом отношении весьма далеко, существует значительное сходство: все они представляют собой вещества белковой природы, и во всех случаях токсичность яда идёт параллельно с содержанием в нём серы.
Впоследствии Гавеман (Havemann) и Вольф (1937) опубликовали специальную работу для доказательства белковой природы активного начала пчелиного яда (апитоксина). Они нашли на основании измерения катафореза частичек кварца в растворах пчелиного яда при различных pH, что апитоксин обладает амфотерным характером. Это свойство, по их мнению, является верным признаком белковой природы апитоксина. Данные, полученные посредством катафореза, проверялись титрованием. При этом оказалось, что апитоксин плохо растворяется в щелочной среде (pH=8,3). Они нашли также изоэлектрическую точку апитоксина, лежащую около pH=8,7, а также установил, что это вещество способно диализировать через пергаментную бумагу и коллодиевую плёнку.
Учитывая данные Гавемана и Вольфа, необходимо всё же иметь в виду, что дело идёт о препарате апитоксина, полученного этими авторами, который, повидимому, представляет собой амфолит. В том же случае, когда налицо имеется солеобразное соединение, частично гидролизирующееся в воде, как например, в опытах Гана и его сотрудников, вряд ли может идти речь об изоэлектрической точке.
5. Сравнительные данные о химическом составе яда перепончатокрылых.
Для того чтобы можно было судить о происхождении и эволюции ядовитого аппарата и яда перепончатокрылых как средства защиты и нападения, было бы весьма желательным располагать данными о химии активных начал яда хотя бы некоторых представителей различных семейств перепончатокрылых. Эти данные помогли бы, как мне кажется, глубже проникнуть в химию самого пчелиного яда, поскольку позволили бы более осмысленно подойти к поискам тех или иных составных частей яда, встречающихся у других перепончатокрылых и понять значение и роль отдельных компонентов яда.
К сожалению, таких данных в настоящее время очень и очень мало. О сходстве в химическом составе яда различных перепончатокрылых мы можем теперь только догадываться на основании сходства в их фармакологическом действии. Впрочем на основании этого последнего критерия мы вправе ожидать, что химические свойства яда настоящих ос, шершней, шмелей и других представителей семейства пчелиных весьма близки между собой. Эти данные будут рассмотрены в следующих главах.
В настоящее время нам известно, что ядовитые секреты перечисленных выше перепончатокрылых обладают кислой реакцией и в их состав входят белки. Кроме того, установлено, что в яде ос (Vespa) имеются пролецитиды, дающие после присоединения лецитина гемолитический токсолецитид. В этом отношении яд ос вполне подобен пчелиному яду [Вальбум, 1915; Бертарелли и Тедески (Bertarelli и Tedeschi), 1913; и др.].
Очень своеобразен и интересен химический состав яда муравьёв. В этом отношении имеется большое различие между муравьями подсемейства Formicinae (Camponotinae), лишёнными жала и способными выбрызгивать свой яд, и остальными четырьмя подсемействами муравьёв, сохранившими жало. Яд муравьёв подсемейства Formicinae характеризуется очень высоким содержанием муравьиной кислоты. Последняя признаётся его главнейшим активным началом. Так, например, в ядовитом секрете широко распространённого в наших лесах муравья Formica rufa содержится, по данным Стумпера (Stumper, 1922), от 21 до 73% муравьиной кислоты. В экстракте тела того же муравья Formica rufa содержится до 18%(!) муравьиной кислоты. Наоборот, муравьиная кислота в теле муравьёв других подсемейств не играет существенной роли.
В таб.6 нами суммированы данные Стумпера о содержании муравьиной кислоты в теле различных муравьёв.
Из таблицы видно, что только муравьи подсемейства Formicinae обладают высоким содержанием муравьиной кислоты в их теле. В теле муравьёв подсемейств Myrmicinae и Dolichoderinae муравьиная кислота отсутствует или, точнее, присутствует в ничтожно малых количествах, как и в теле других перепончатокрылых. По данным Эльзера (Elser, 1924) и Флури (1919), в кишечнике пчёл содержится до 0,02мг муравьиной кислоты, что составляет 0,3-0,46% от веса кишечного содержимого. Кроме того, некоторые количества муравьиной кислоты содержатся в мёде, а следы её имеются в пчелином яде, как об этом было сказано выше.
По видимому, способность образовывать муравьиную кислоту присуща ядовитым железам перепончатокрылых, но у большинства из них эта способность выражена очень неясно и только у муравьёв подсемейства Formicinae проявляется в максимальной степени. Возникает вопрос о причинах, которые в эволюции этой ветви перепончатокрылых обусловили полное проявление способности образовывать муравьиную кислоту?
В литературе этот вопрос не только не обсуждался, но даже не был поставлен. Мне кажется, что это явление можно понять, если поставить его в связь с изменившимся (в зависимости от образа жизни) характером защитной реакции муравьёв, что привело к потере жала, выработке приспособлений к выбрызгиванию яда и к возрастанию в яде количества муравьиной кислоты.
В самом деле, муравьи этой группы, живущие под землёй в так называемых муравьиных кучах, принуждены защищаться главным образом от крупных млекопитающих и птиц, которые могут разрушать их постройки. Естественно, муравьи животные, лишённые крыльев, очень мелкие, со слабым жалящим аппаратом, были бы бессильны в борьбе с этими крупными и подвижными врагами, если бы при защите пытались "ужалить" нападаюших, наподобие своих крылатых, более крупных, подвижных и сильно вооружённых сородичей из семейства пчёл или ос. Поэтому, в процессе естественного отбора характер защитной реакции муравьёв изменился. Слабый жалящий аппарат редуцировался совсем, вместо него возникли приспособления для выбрызгивания яда. Количество яда резко возросло и его состав также резко изменился. Доминирующим фактором яда стало обладающее резким запахом, жгучее, едкое вещество - муравьиная кислота, способное отпугивать нападающих на муравейник птиц и млекопитающих, особенно если это вещество, выпрыскиваемое на расстоянии, может попасть в глаза или на слизистые оболочки нападающего. Действительно, если потревожить муравейник, то можно наблюдать, как множество тоненьких струек ядовитой жидкости будет подниматься вверх над муравейником.
Из всех ядовитых начал, встречающихся в яде перепончатокрылых, роль "отпугивающего" вещества могла сыграть только муравьиная кислота; все остальные токсические вещества для осуществления своего действия нуждаются во введении их в кровь врага. На базе этого предположения можно понять причины, приведшие в процессе эволюции к резкому возрастанию количества муравьиной кислоты в яде лишённых жала муравьёв.
6. Вопрос о способах приготовления препаратов пчелиного яда для терапевтических целей.
В заключение этой главы остановимся на весьма важном практическом вопросе о методах изготовления препаратов пчелиного яда для нужд терапевтической практики.
В настоящее время за границей в продаже находятся разнообразные препараты пчелиного яда. К сожалению, до сего времени в СССР эти препараты ещё не вырабатываются. В основном все препараты пчелиного яда можно разделить на две группы. С одной стороны, это препараты для подкожных инъекций, с другой - для втирания в кожу. Основная цель, которую ставили себе исследователи при разработке метода получения всех этих препаратов, заключалась в том, чтобы очистить пчелиный яд от балластных веществ, главным образом белков, которые могли бы играть роль анафилактогенных факторов, а также веществ, обусловливающих боль при введении яда; вместе с тем было необходимо сохранить активные начала яда, играющие роль терапевтических факторов. Эта цель достигнута в целом ряде заграничных препаратов, если судить об этом по отзывам врачей, применявших их в своей терапевтической практике. К сожалению, методы приготовления всех этих препаратов нам неизвестны, так как они запатентованы и секрет из изготовления оберегается выпускающими их предприятиями. В своей монографии, посвящённой лечению пчелиным ядом, Бек (1935) пишет, что его попытка приготовления препарата пчелиного яда не увенчалась успехом. Он замечает, что полученный им пчелиный яд был "ещё не годен для терапевтических целей, так как протеины должны быть совершенно удалены, что представляется очень сложной задачей". Далее он не без горечи добавляет: "иностранные фабриканты старательно охраняют секрет метода, посредством которого они элиминируют протеин. Автор до сих пор не мог, даже с помощью экспертов-химиков, изготовить свободный от белка раствор, годный для инъекций, и не достиг никакого соглашения с иностранными фабрикантами".
Мне кажется, что очередной назревшей потребностью советских исследователей является разработка оригинального метода очистки пчелиного яда для того, чтобы создать свой препарат яда для терапевтического применения. Судя по заключениям авторитетнейших представителей медицинской науки Европы и Америки, препараты пчелиного яда представляют собой такую большую ценность в борьбе с ревматизмом, что отсутствие их на нашем фармацевтическом рынке недопустимо.
О размерах производства препаратов пчелиного яда на Западе мы можем судить по сведениям, опубликованным Ганом (1939). Этот автор сообщает, что на химической фабрике Мак и наследники (Mack Nachf)в Иллертиссене, близ Ульма, ежегодно обрабатывается 3000 пчелиных семей летом и около 1500 зимой. На этой фабрике работают большое число рабочих, добывающих яд, а также химики и зоологи, изучающие наиболее рациональные способы получения и обработки пчелиного яда.
Разработка метода получения полноценного препарата пчелиного яда должна быть осуществлена в Советском Союзе возможно быстрыми темпами. Работа в этом отношении начата в лаборатории покойного акад. Кроля. Необходимо её продолжать дальше.
1. Физико-химические свойства пчелиного яда.
2. Методы добывания пчелиного яда.
3. Действие на пчелиный яд различных физико-химических факторов и хранение пчелиного яда.
4. Химический состав пчелиного яда и вопрос об его активных началах.
5. Сравнительные данные о химическом составе яда перепончатокрылых.
6. Вопрос о способах приготовления препаратов пчелиного яда для терапевтических целей.
